PCR擴增實(shí)驗試劑盒組成及試劑配制:
1、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?，分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時(shí)間；4．循環(huán)次數；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應體系與反應條件。

?

實(shí)驗過(guò)程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長(cháng)期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設立一個(gè)的PCR實(shí)驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿(mǎn)意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jì)Υ?，從而確保實(shí)驗與實(shí)驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽(yáng)性對照)，每個(gè)測試反應體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應加入的量 N個(gè)反應加入的量
熒光PCR反應液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個(gè)PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽(yáng)性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
鏈霉親和素Phospho-c-Cbl (Tyr774) Antibody(2R,4S)-羥基吡咯烷-2-羧酸

西他沙星Phospho-RSK2 (Ser227) (D53A11) Rabbit mAb甲酸甲酯

DHBS；3,5-二-2-羥基磺酸鈉TGM2 (D11A6) XP® Rabbit mAb-甲

NBD-PZ；硝基-7-哌并氧雜噁二唑TGM2 (D11A6) XP® Rabbit mAbL-酪氨酸甲酯鹽酸鹽

BGP；β-甘油酸鈉水合物(高純)LDHA/LDHC (C28H7) Rabbit mAb6-甲基吲哚

Fura 2-AM;鈣熒光探針Progesrone Receptor A/B (D8Q2J) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjuga)三水六氟酮

NBD-F；氟-7-硝基-2,1,并氧雜惡二唑CCT2 Antibody溴噻唑

魯米諾,發(fā)光氨Acetyl-α-Tubulin (Lys40) (D20G3) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjuga)2-氨基-甲基-5-溴吡啶

Leu-pNA；L-亮氨酸-CRMP-2 (D8L6V) Rabbit mAb2-噻吩

BAEE;N-甲?；?L-精氨酸酯鹽酸鹽SOAT1 Antibody甲基嘧啶

TAME.HCl；NA-P-甲磺基-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽CD34 (ICO115) Mouse mAb溴五氟

AE；N-酰-L-酪氨酸酯CD44 (156-3C11) Mouse mAb2-氟二酸二甲酯

DAPI；4，’6-二脒基-2-基吲哚CD44 (156-3C11) Mouse mAb2-氨基-5-硝基-2'-氟二甲酮

基-α-D-吡喃半糖苷CD109 Antibody2-氨基-6-(三氟甲基)吡啶

ABTS;2,2'-聯(lián)氨-雙（基并噻唑啉-6-磺酸）二鹽Phospho-CD19 (Tyr531) Antibody5--2-氟

β-D-葡糖糖-6-酸鈉鹽Phospho-CD19 (Tyr531) Antibody6-甲氧基-2-萘甲

HEPBS；N-(2-羥基)哌-N'-(丁磺酸）PTMScan® Peptide Purification Kit鄰氟芐

赫斯特熒光燃料33258CD19 Antibody鹽酸洛哌丁

高密度脂蛋白(HDL)ELISA試劑盒phospho-SHC (Tyr349)  酸化SH2結構域轉化蛋白1100 ul

高靈敏度促甲狀腺激素(U-TSH)ELISA試劑盒phospho-SHC (Tyr427)  酸化SH2結構域轉化蛋白120 ul

高半胱氨酸(Hcy)ELISA試劑盒phospho-SHC (Tyr317)  酸化SH2結構域轉化蛋白1100 ul

肝脂酶(HL)ELISA試劑盒phospho-SHC (Tyr239/240)  酸化SH2結構域轉化蛋白1100 ul

肝臟型脂肪酸結合蛋白(L-FABP)ELISA試劑盒Shiga-like toxin IIe variant subunit A  大腸桿菌志賀樣毒素Ⅱ型突變體（O139菌型）100 ul

肝細胞生長(cháng)因子受體(c-MET/HGFR)ELISA試劑盒Shh/Sonic hedgehog  Shh信號轉導通路膜蛋白受體20 ul

肝細胞生長(cháng)因子激活物(HGFA)ELISA試劑盒OMPC  大腸桿菌外膜孔道蛋白C1 Kit

肝細胞生長(cháng)因子(HGF)ELISA試劑盒SHIP1  SH2結構含酸肌醇SHIP1100 ul

肝素結合EGF樣生長(cháng)因子(HBEGF)ELISA試劑盒Phospho-SHIP1 (Tyr1020)  酸化SH2結構含酸肌醇SHIP1100 ul
PCR擴增實(shí)驗試劑盒磷酸化促凋亡調節蛋白BNIP3抗體Isoerysenegalensein E中文名：別名：分子式：C25H26O6

B淋巴細胞特異性激活OCT結合蛋白1抗體8-Prenylnaringenin中文名：8-異戊烯基柚皮素別名：分子式：C20H20O5

核糖體合成蛋白BOP1抗體Auriculasin中文名：別名：分子式：C25H24O6

調節中心體分離早期相關(guān)激酶BORA抗體8-Demethylsideroxylin中文名：別名：分子式：C17H14O5

萊姆病螺旋體抗體Syzalterin中文名：別名：6,8-Dimethylapigenin分子式：C17H14O5