PCR擴增試劑盒的標準品（凍干品）臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋?zhuān)謩e配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔0 U/L。如配制100 U/L標準品則取0.3ml（不要少于0.3ml）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
PCR擴增試劑盒使用時(shí)要注意基礎程序、擴增溫度和延伸溫度、反應時(shí)間、循環(huán)次數、PCR反應液的配制、PCR的反應動(dòng)力學(xué)、PCR擴增產(chǎn)物以及PCR反應體系與反應條件。
若在進(jìn)行PCR實(shí)驗時(shí)擴增產(chǎn)物出現雜帶該如何處理？
對于該現象可能的原因和對應的處理策略如下：
1.引物用量偏大，引物的特異性不高。應調換引物或降低引物的使用量。
2.循環(huán)的次數過(guò)多。適當增加模板的量，減少循環(huán)次數。
3.酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應降低酶量或調換另一來(lái)源的酶。
4.退火溫度偏低，退火及延伸時(shí)間偏長(cháng)。應提高退火溫度，減少變性與延伸時(shí)間，也可采用二種溫度的PCR擴增。以2℃為梯度設計梯度PCR反應優(yōu)化退火溫度。
5.樣品處理不當。
6.Mg2+濃度偏高，因適當調整Mg2+使用濃度。
7.若為PCR試劑盒，也可能時(shí)試劑盒本身質(zhì)量有問(wèn)題。推薦使用PCR擴增試劑盒，添加改良的DNA聚合酶，大大提高擴增產(chǎn)物的特異性和保真性。
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更新時(shí)間：2022-08-23
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