注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時(shí)間；4．循環(huán)次數；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應體系與反應條件。

組成及試劑配制:
1、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?，分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗過(guò)程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長(cháng)期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設立一個(gè)的PCR實(shí)驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿(mǎn)意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jì)Υ?，從而確保實(shí)驗與實(shí)驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
鑭標準溶液(1000μg/ml)Annexin A2 (D11G2) Rabbit mAb (PE Conjuga)哌啶基哌啶

鑭標準溶液(1000μg/ml in 10% HCl)CTLA-4 (D4E9I) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjuga)(R)-(+)-1,1,2-三基-1,2-二2-(醋)酸酯

镥標準溶液(1000μg/ml in 10%HCl)HDAC4 (D8T3Q) Rabbit mAb2,2'-二羥基-甲氧基二甲酮

錳標準溶液(1000μg/ml,基質(zhì):1.0 mol/L HNO3)PD-L1 (Extracellular Domain Specific) (E1J2J™) Rabbit mAb2--甲基-氟甲

錳標準溶液(500mg/L,溶劑：1%硝酸)FAM3C (D1S2D) XP® Rabbit mAb2-溴--5-硝基吡啶

水質(zhì)錳標樣(1.0mg/L in H2O,分析標準品)IGF-I Receptor β Blocking Peptide1,2,3,四氫化喹喔啉

錳標準溶液(100µg/mL,基體:1%HNO3)SLAMF6/CD352 Antibody2--溴-6-甲基吡啶

鎂標準溶液(濃度范圍:0.197(mg/L),分析標準品)Jarid1B (E2X6N) Rabbit mAb氨基戊烷

鎂標準溶液(1000µg/mL,基體:5%HCl)DCP1A (D6V1R) Rabbit mAb2,6-二甲基吡啶 N-氧化物

鎂標準溶液(500mg/L,溶劑：1%鹽酸)LAG3 (D2G4O™) XP® Rabbit mAb2,2'-亞甲基雙-(叔丁基-基酚)

鎂標準溶液(1000μg/ml)LAG3 (D2G4O™) XP® Rabbit mAb六甘

鉬標準溶液(1000μg/ml)F3/Contactin (D7D4X) Rabbit mAb二二二基

鉬標準溶液(100µg/mL,基體: 1%HCl)CD80 (E3Q9V) Rabbit mAb溴-2,6-二甲

水質(zhì)鎳標樣(濃度范圍:0.959-1.01(mg/L),分析標準品)Ron (C81H9) Rabbit mAb (Biotinylad)羧酸甲酯-5-酸

鈮標準溶液(1000μg/ml)FastScan™ Phospho-HSP27 (Ser82) ELISA KitL-樟腦酸

鎳標準溶液(100μg/mL，基體:1%HNO3)ANP32A (D7Z5U) Rabbit mAbL-基氨酸

釹標準溶液(1000μg/ml)Malic Enzyme 2 (E1N3E) XP® Rabbit mAb鋇鐵氧體

標準溶液(500mg/L,溶劑：水)Malic Enzyme 2 (E1N3E) XP® Rabbit mAb反式-2,二溴-2--1,二

表皮生長(cháng)因子受體2(sp185/Her2)ELISA試劑盒IL5RA/CD125  白介素-5受體α鏈100 ul

表皮生長(cháng)因子受體(EGFR)ELISA試劑盒IL-6   白介素6()100 ul

表皮生長(cháng)因子(EGF)ELISA試劑盒IL-6  白介素6(大、)100 ul

表睪酮ELISA試劑盒IL-6  白介素6100 ul

表達于SiSo細胞系的受體結合型腫瘤抗原(RCAS1)ELISA試劑盒IL-7  白介素7100 ul

變腎上腺素(MN)ELISA試劑盒IL-6R Alpha  白細胞介素6受體α100 ul

鞭毛蛋白(flagellin)ELISA試劑盒IL-6R Beta/CD130/gp130  白細胞介素6受體β100 ul

臂板蛋白4C(Sema 4C)ELISA試劑盒IL-8/CXCL8  白介素8100 ul

臂板蛋白3F(S3F)ELISA試劑盒IL-8/CXCL8 (mouse, rat)  白介素8 （，）20 ul
人細胞色素P基因PCR檢測試劑盒說(shuō)明書(shū)癌相關(guān)蛋白3抗體5,7,3',4'-Tetrahydroxy-3-methoxy-8-geranylflavone中文名：別名：分子式：C26H28O7

癌相關(guān)蛋白2抗體Erythrinin F中文名：別名：分子式：C20H18O7

腦環(huán)核苷酸門(mén)控通道蛋白1抗體Myricetin 3-O-galactoside中文名：楊梅素-3-O-半乳糖苷別名：分子式：C21H20O13

癌擴增序列蛋白4抗體9-O-Methyl-4-hydroxyboeravine B中文名：別名：分子式：C18H14O7

促凋亡BNIP3L蛋白抗體Genistin中文名：染料木苷別名：分子式：C21H20O10
檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽(yáng)性對照)，每個(gè)測試反應體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應加入的量 N個(gè)反應加入的量
熒光PCR反應液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個(gè)PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽(yáng)性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。