旋毛蟲(chóng)通用探針?lè )晒釶CR檢測試劑盒操作流程:

1. 整個(gè)檢測過(guò)程應嚴格按照本說(shuō)明書(shū)要求分別在試劑準備區、樣本處理區和PCR擴增區進(jìn)行操作,各區實(shí)驗服、儀器 、耗材應獨立使用,不能混用;實(shí)驗用吸頭采用帶濾芯吸頭;樣本處理區應配有生物安全柜,樣本處理在生物安全柜中進(jìn)行操作;三個(gè)區應該配有紫外線(xiàn)殺菌裝置。

2. 為避免RNA降解,樣本處理過(guò)程應在0-4℃條件下操作,且完成實(shí)驗后立即上機檢測;樣本處理過(guò)程中使用的器具耗材應經(jīng)過(guò)無(wú)核酶處理。

3. 每次實(shí)驗應該設置陰、陽(yáng)性對照。

4. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻,并應瞬時(shí)離心。

5. 試劑盒內所配陰性和陽(yáng)性對照在一次使用前應全部轉移至標本準備區,并單獨存放。

6. 為防止熒光干擾,應避免裸手直接接觸PCR反應管,并應避免在PCR反應管上進(jìn)行任何標記。

7. 儀器 擴增相關(guān)參數應按照本說(shuō)明書(shū)相關(guān)要求進(jìn)行設置;不同批號試劑不能混用。

8. ABI系列熒光定量PCR儀參數設置中不選ROX校正,淬滅基因選擇None。

9. 實(shí)驗過(guò)程中產(chǎn)品的廢棄物應該進(jìn)行無(wú)害化處理后方可丟棄。產(chǎn)品僅供科研使用

熒光染料的缺點(diǎn)：

不能區分不同的雙鏈DNA

引物二聚體會(huì )影響檢測的敏感性

非特異性產(chǎn)物會(huì )影響結果的敏感性

引物二聚體和非特異性擴增問(wèn)題可以通過(guò)熔解曲線(xiàn) (Melting curve) 進(jìn)行識別，進(jìn)而通過(guò)PCR引物的設計和反應條件的優(yōu)化得以解決?？偟膩?lái)說(shuō)，SYBR Green I方法是一種基礎也的Real-time qPCR實(shí)驗手段。