注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時(shí)間；4．循環(huán)次數；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應體系與反應條件。

組成及試劑配制:
1、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?，分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗過(guò)程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長(cháng)期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設立一個(gè)的PCR實(shí)驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿(mǎn)意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jì)Υ?，從而確保實(shí)驗與實(shí)驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
HOBT大鼠骨髓基質(zhì)細胞*培養基異香草 98%

NHS大鼠食管上皮細胞*培養基丁酸甲硫酯 98%

GABA大鼠食管平滑肌細胞*培養基甲硫 99%

γ-L-Glutamyl-α-naphthylamide大鼠腸平滑肌細胞*培養基吡 99%

γ-L-Glutamyl-β-naphthylamide大鼠腸粘膜上皮細胞*培養基吡 98%

H-Glu-PNA大鼠腸動(dòng)脈內皮細胞*培養基2,3,5-*基吡 99%

L-Glutamic acid γ-(3-carboxy-4-nitroanilide) ammonium salt大鼠腸靜脈內皮細胞*培養基2,3,5-*基吡 ≥99%, FCC, Kosher, FG

GSSG大鼠肝實(shí)質(zhì)細胞*培養基異戊酸乙酯 99%

GSH大鼠肝動(dòng)脈內皮細胞*培養基異戊酸乙酯 ≥99%, FCC, Kosher, FG

Histamine diphospate大鼠肝動(dòng)脈平滑肌細胞*培養基(±)-2-甲基-1-丁 98%

Histamine大鼠小腸血管內皮細胞*培養基3,4-二甲氧基苯甲 99%

Histamine dihydrochloride大鼠小腸隱窩上皮細胞*培養基2',6'二氯-3'-氟苯乙酮   97%

L-Carsine大鼠肝內膽管上皮細胞*培養基2,4-二氯-3-硝基-5-氟苯甲酸  97%

L-Dopa大鼠胃粘膜上皮細胞*培養基4-氟苯乙酮 98%

T4大鼠肝竇內皮細胞*培養基對氟苯甲酸 98%

L-thyroxine sodium大鼠肝星形細胞*培養基4'-乙酮 99%

埃替非巴肽，依非巴特;安普利肽，依非巴肽Sox2  胚胎干細胞關(guān)鍵蛋白TAF12  TATA框結合蛋白關(guān)聯(lián)因子12抗體

鹽酸埃羅替尼TSFP1/SP1(transcription factor Sp1)  SP1轉錄生長(cháng)因子抗原TACR3  速激肽受體3抗體

鹽酸埃羅替尼（標準品）SPARC (secreted protein acidic and rich in cysteine)  富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白抗原TACC2/ AZU1  轉化酸性卷曲含蛋白質(zhì)2

爾它培南鈉;厄他培南鈉SRF(Serum response factor)  血清應答因子抗原TACC1  癌、胃癌抗原GA55抗體

雌二,β-雌二SREBP-1(Sterol Regulatory Element Binding Protein-1)  固醇調節元件結合蛋白1抗原TAAL6/Transmembrane 4 L6 family member 1  腫瘤相關(guān)抗原L6抗體

雌二,β-雌二（標準品）AKAP12A/SSeCKS peptide  絲氨酸抑制蛋白激酶C底物抗原TAAL6  腫瘤相關(guān)蛋白抗原L6抗體

苯甲酸雌二Fut4/CD15/SSEA-1(Stage-specific embryonic surface antigen 1)  階段特異性胚胎表面抗原-1抗原T7 tag  T7 tag標簽抗體

苯甲酸雌二（標準品）SSTR1 (somatostatin receptor 1)  生長(cháng)抑素受體1(SSTR1)抗原T4/L-Thyroxine  甲狀腺素T4抗體

雌三SSTR2 (somatostatin receptor 2)  生長(cháng)抑素受體2抗原T4/L-Thyroxine  甲狀腺素T4抗體

雌三(標準品)SSTR3 peptide  生長(cháng)抑素受體3抗原T3  *狀腺素T3抗體
巴氏*線(xiàn)蟲(chóng)PCR檢測試劑盒廠(chǎng)家人促甲狀腺素釋放激素(TRH)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：保存：-20℃1KU

人促卵泡素(FSH)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：250毫克

人促腎上皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：保存：-20℃500u

人促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：50毫克

人促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：20毫克

人促生長(cháng)激素釋放激素(GHRH)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：保存：-20℃500u

人促睡眠肽(DSIP)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：1000u

人促胃液素受體(GsaR)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：保存：-20℃15KU
檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽(yáng)性對照)，每個(gè)測試反應體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應加入的量 N個(gè)反應加入的量
熒光PCR反應液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個(gè)PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽(yáng)性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。