注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時(shí)間；4．循環(huán)次數；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應體系與反應條件。

組成及試劑配制:
1、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?，分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
?
實(shí)驗過(guò)程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長(cháng)期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設立一個(gè)的PCR實(shí)驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿(mǎn)意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jì)Υ?，從而確保實(shí)驗與實(shí)驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
PCPG中性蛋白酶(含10mL酶解緩沖液)酸鋅 Anhydrous

DL-2-(2-Chlorophenyl)glycine中性蛋白酶(含100mL酶解緩沖液)3.5酸鋅 粒度 1~2μm

L-(+)-2-Chlorophenylglycine膠原酶(含10mL酶解緩沖液)3.5酸鋅 粒度 2~5μm

CBZ-CL膠原酶(含100mL酶解緩沖液)3.5酸鋅 粒度 6~10μm，防腐級

N-BZ-Val-Gly-Arg PNA•HC1彈性蛋白酶(含10mL酶解緩沖液)氟苯 99%

D-Val-Leu-Lys PNA•2HC1彈性蛋白酶(含100mL酶解緩沖液)氟化苯標準溶液 質(zhì)分析標準溶液，1mg/ml 溶液

Z-Gly-Pro-Arg PNA acetate salt透明質(zhì)酸酶(含10mL酶解緩沖液)氟苯 Standard for GC ,≥99.6% (GC)

sodium Sarcosine透明質(zhì)酸酶(含100mL酶解緩沖液)氟苯 CP

L-Aspartic acid calcium salt木瓜蛋白酶(含10mL酶解緩沖液)氟苯 分析標準品

L-Glutamic acid 5-methyl ester木瓜蛋白酶(含100mL酶解緩沖液)己酸丁酯 standard for GC, ≥99.5% (GC)

N-Benzylglycine ethyl ester胰凝乳蛋白酶(含10mL酶解緩沖液)己酸丁酯 ≥98%

L-tert-Leucine胰凝乳蛋白酶(含100mL酶解緩沖液)丁位十二內酯 98%

L-tert-Leucine hydrochloride(R)-(-)-3-甲基-2-丁胺 98%, ee 97%丁酸乙酯 99%

L-Homoserine(S)-(+)-3-甲基-2-丁胺 98+%, ee 99%異戊 98%

D-allo-Isoleucine2-氨基苯甲 99%異戊 Standard for GC,>99%(GC)

AspartameDL-3-氨基丁酸 97%異戊 ≥97%，Kosher

奧沙利鉑（標準品）COX-2 (Prostaglandin-endoperoxide synthase-2)  前列腺素氧化環(huán)化酶2(抗原)Sprouty1  軟脂?；椎鞍譙prouty1抗體

硝酸奧昔康唑c-phycocyanin(C-PC)  C-藻藍素(藻藍蛋白)Sprouty 2  快速發(fā)育生長(cháng)因子同源蛋白2抗體

鹽酸土霉素CTGF (connective tissue growth factor)  結締組織生長(cháng)因子(多肽抗原)SPP24/SPP2  分泌性磷蛋白24抗體

鹽酸土霉素(標準品)Cyclin E  周期素E/原癌基因抗原SPP/Signal Peptide Peptidase  信號肽肽酶SPP抗體

縮宮素,醋酸催產(chǎn)素Dnmt3a(cytosine-5)-methyltransferase 3A)  DNA甲基轉移酶-3α(抗原)SPON2/M spondin/Mindin  細胞外基質(zhì)底物反應蛋白2抗體

紫杉Cyclin C  周期素 C(抗原)SPON1/F spondin  細胞外基質(zhì)底物反應蛋白1抗體

紫杉（標準品）CGRP (calcitonin gene related peptide, CGRP)  降鈣素基因相關(guān)肽SPO11  減數分裂重組蛋白SPO11抗體

鹽酸帕洛諾司瓊CULLIN (Cdc53/CUL)  SPNS1  SPNS1抗體

硫酸巴龍霉素CYP450(Cytochrome P450 mooxygenase)  細胞色素P450單氧化酶(多肽抗原)SPINT2/HAI2/HGFA Inhibitor 2  肝細胞生長(cháng)因子激活抑制蛋白2抗體

硫酸巴龍霉素(標準品)CXorf36(uncharacterized protein Cxorf36 precursor)  脫羧酶蛋白體36 cxorf36抗原SPINK1/SPINK3  腫瘤相關(guān)胰蛋白酶抑制劑1抗體
新星諾卡菌PCR檢測試劑盒規格人二肽基肽酶Ⅳ(DPPⅣ)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT10克

人發(fā)動(dòng)蛋白2(DNM2)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：100毫克

人法尼基二磷酸法尼基轉移酶1(FDFT1)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：25克

人反*狀腺原氨酸(rT3)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT500克

人泛素蛋白(Ub)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：25克

人泛素蛋白D(UBD)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：1個(gè)

人泛素分解酶(DUB)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT10克

人泛素激活酶(E1/UBAE)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：1公斤
檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽(yáng)性對照)，每個(gè)測試反應體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應加入的量 N個(gè)反應加入的量
熒光PCR反應液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個(gè)PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽(yáng)性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。