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注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時(shí)間；4．循環(huán)次數；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應體系與反應條件。

實(shí)驗過(guò)程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長(cháng)期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設立一個(gè)的PCR實(shí)驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿(mǎn)意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jì)Υ?，從而確保實(shí)驗與實(shí)驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽(yáng)性對照)，每個(gè)測試反應體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應加入的量 N個(gè)反應加入的量
熒光PCR反應液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個(gè)PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽(yáng)性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
組成及試劑配制:
1、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?，分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
吉馬酮（標準品）Phospho-SHP-2 (Tyr580) (D66F10) Rabbit mAb2-羥基-6-萘甲酸

加蘭他敏（標準品）Phospho-SHP-2 (Tyr580) (D66F10) Rabbit mAb2-硝基-甲砜

甲基蓮心（標準品）IP6K3 (D9O7J) Rabbit mAb硫氫化鈉

5-O-甲基維斯阿米苷（標準品）RACK1 (D59D5) Rabbit mAb異基肼鹽酸鹽

N-甲基野靛（標準品）Galectin-9 (D9R4A) XP® Rabbit mAb5-硝基吲哚-2-羧酸酯

9-甲氧基喜樹(shù)（標準品）Galectin-9 (D9R4A) XP® Rabbit mAb氧基酮

10-姜酚（標準品）FastScan™ Phospho-Akt1 (Ser473) ELISA Kit酸

6-姜酚（標準品）RF2IP (D9H4) Rabbit mAb基三基化膦

8-姜酚（標準品）Jagged1 (D4Y1R) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjuga)環(huán)戊基異酸酯

姜酮(標準品)EGF Receptor (D1D4J) XP® Rabbit mAb (Neutralizing)(S)-羥基哌啶鹽酸鹽

姜酮(標準品)EGF Receptor (D1D4J) XP® Rabbit mAb (Neutralizing)(S)-1-N-叔丁氧羰基-2-(氨基基)哌啶

6-姜酚（標準品）FoxM1 (D12D5) XP® Rabbit mAb2-酰酸甲酯

絞股藍皂苷XLIX(標準品)FoxM1 (D12D5) XP® Rabbit mAbN-甲基-1,2-二

YM-201636MMP-1 (E9S9N) Rabbit mAb2,2-二羥甲基酸

金石蠶苷（標準品）ERCC1 (D61F5) Rabbit mAb1-萘甲

金絲桃苷(標準品)Phospho-Histone H2A.X (Ser139/Tyr142) Antibody2-

京尼平(標準品)SKAR α/β (D65E8) XP® Rabbit mAb五甘

阿非迪霉素；艾菲地可寧LRP5 (D5G4) Rabbit mAb1,8-二氨基萘

胞質(zhì)脫氫酶1CD117/FITC  熒光素標記CD117IgG100 ul

ADP核糖基化樣因子ARL3CD133 gen/FITC  熒光素標記造血干細胞抗原CD133IgG100 ug

花生四酸15脂氧合酶1OX40/CD134/TNFRSF4/FITC  熒光素標記CD134IgG100 ul

癌增強蛋白2IL-7Ra/CD127/PE   熒光素PE標記兔抗、大、、馬、兔白細胞介素-7受體aIgG100 ul

α1微球蛋白CD137/TNFRSF9/FITC  熒光素標記CD137IgG100 ul

α晶狀體球蛋白B/αB-crystallinCD133 antigen/PE  熒光素藻紅蛋白標記兔抗、大、和果蠅CD133IgG100 ul

腺苷A2b受體/神經(jīng)生長(cháng)因子1受體HVEM/TNFRSF14/FITC  熒光素標記腫瘤壞死因子受體超家族成員14IgG100 ul

AMPK的相關(guān)蛋白激酶5Syndecan-1/CD138/FITC  熒光素標記多配體聚糖IgG100 ul

致瘤蛋白32相關(guān)蛋白1CD141/FITC  熒光素標記凝血調節蛋白IgG100 ul
空腸彎曲菌(CJ)核酸試劑盒規格BarX1蛋白抗體Leucoside中文名：別名：Kaempferol 3-O-sambubioside分子式：C26H28O15

Bcl-2同源結構域樣蛋白1抗體Quercetin 3-O-robibioside中文名：槲皮素-3-O-刺槐二糖苷別名：槲皮素-3-O-洋槐糖苷分子式：C27H30O16

染色體相關(guān)蛋白CAP抗體Bavachin中文名：補骨脂二氫黃酮別名：4',7-Dihydroxy-6-prenylflavane分子式：C20H20O4

骨/軟骨蛋白多糖1抗體Kaempferol 5,7,4'-trimethyl ether中文名：酚-5,7,4'-*醚別名：3-Hydroxy-5,7,4'-trimethoxyflavone分子式：C18H16O6

嗜乳脂蛋白亞家族2成員A2抗體biletin中文名：川陳皮素別名： 3',4',5,6,7,8-Hexamethoxyflavone分子式：C21H22O8