注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時(shí)間；4．循環(huán)次數；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應體系與反應條件。

組成及試劑配制:
1、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?，分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗過(guò)程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長(cháng)期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設立一個(gè)的PCR實(shí)驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿(mǎn)意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jì)Υ?，從而確保實(shí)驗與實(shí)驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
橙黃決明素(標準品)Synapsin-1 (D12G5) XP® Rabbit mAb5-溴戊酸酯

橙皮苷(標準品）Synapsin-1 (D12G5) XP® Rabbit mAb芐氧基酸

橙皮苷FoxP3 (D25D4) Rabbit mAb9-蒽

橙皮素(標準品)Atg4B Antibody三基膦化銠

蟲(chóng)草素(標準品)Phospho-cPLA2 (Ser505) (D4I2A) Rabbit mAb-甲酸甲酯

川陳皮素;蜜橘黃素GAD1 Antibody鹽酸海拉明

川陳皮素(標準品)mNeonGreen Tag Antibody氟-2-甲

川楝素(標準品）AMPA Receptor 2 (GluA2) (D39F2) Rabbit mAb2-吲哚甲酸

川芎(標準品)AMPA Receptor 2 (GluA2) (D39F2) Rabbit mAb2-氨基-5-并噻唑

川芎GAP43 Antibody丁二酸單酯酰

川續斷皂苷VI；木通皂苷D（標準品）SNAP25 (D7B4) Rabbit mAb阿糖胞苷

川續斷皂苷（標準品）SNAP25 (D9A12) Rabbit mAbN-(氨基磺?；?氨酸叔丁酯

次(標準品)Semaphorin-4D/CD100 (E5C3B) XP® Rabbit mAb二氧化硅

次野鳶尾黃素（標準品）Semaphorin-4D/CD100 (E5C3B) XP® Rabbit mAbL-2 DIAMINOBUTYRIC ACID MONOHYDRO-CHLO

刺芒柄花苷（標準品）PTP1B Antibody甲基吡啶-酸

刺五加苷E（標準品）Human RANKL/TRANCE/TNFSF11 (hRANKL)四正辛基溴化銨

刺五加皂苷B（標準品）Human RANKL/TRANCE/TNFSF11 (hRANKL)噻菌靈

醋酸辛酯（標準品）RBPSUH (D10A4) XP® Rabbit mAb5--2-酸

酸化活化復制因子2CD19/FITC  熒光素標記CD19IgG100 ul

酸化活化復制因子2Phospho-CD19 (Tyr531) /FITC  熒光素標記兔抗、大、CD19IgG100 ul

酸化活化復制因子2CD19/PE  熒光素PE標記CD19IgG20 ul

酸化活化復制因子2CD20/FITC  熒光素標記CD20IgG400 ul

酸化活化復制因子2CD20/Biotin  生物素化CD20IgG400 ul

活化轉錄因子5CD20/MS4A1/PE  熒光素PE標記CD20IgG100 ul

活化轉錄因子6βCD25/IL-2RA /PE-Cy5  熒光素PE-Cy5標記兔抗、大、白介素2受體a鏈IgG400 ul

AICAR甲?；D移酶CD22/FITC  熒光素標記抗白細胞分化抗原CD22IgG100 ul

酸化毛細血管擴張性共濟失調癥突變蛋白CD23/Fc EpsilonR II /FITC  熒光素標記CD23IgG100 ul
副溶血性弧菌(VP)核酸試劑盒廠(chǎng)家8號染色體開(kāi)放閱讀框77抗體4'-Hydroxywogonin中文名：4'-羥基漢黃芩素別名：4',5,7-Trihydroxy-8-methoxyflavone分子式：C16H12O6

補體C9b抗體Acacetin中文名：金合歡素別名：5,7-Dihydroxy-4'-methoxyflavone; 刺槐素分子式：C16H12O5

9號染色體開(kāi)放閱讀框103抗體Isosinensetin中文名：異橙黃酮別名：分子式：C20H20O7

9號染色體開(kāi)放閱讀框131抗體Gallocatechin中文名：沒(méi)食子兒茶素別名：分子式：C15H14O7

9號染色體開(kāi)放閱讀框135抗體Catechin pentaacetate中文名：兒茶素全乙酸酯別名：分子式：C25H24O11
檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽(yáng)性對照)，每個(gè)測試反應體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應加入的量 N個(gè)反應加入的量
熒光PCR反應液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個(gè)PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽(yáng)性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。