組成及試劑配制:
1、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?，分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時(shí)間；4．循環(huán)次數；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應體系與反應條件。

?

實(shí)驗過(guò)程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長(cháng)期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設立一個(gè)的PCR實(shí)驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿(mǎn)意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jì)Υ?，從而確保實(shí)驗與實(shí)驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽(yáng)性對照)，每個(gè)測試反應體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應加入的量 N個(gè)反應加入的量
熒光PCR反應液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個(gè)PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽(yáng)性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
靛藍二磺酸鈉ATP2A1/SERCA1 (L24) Antibody羥基-甲酸

變色酸鈉,鉻變酸二鈉HMGCS1 (D1Q9D) Rabbit mAb氟-三氟酚

溴百里酚藍鈉鹽Phospho-Tie2 (Tyr992) Antibody衣康酸二甲酯

特地唑游離CDC37 (D28H7) Rabbit mAbN,N-二酰

水合;三Bcl-2 (D55G8) Rabbit mAb (Human Specific)聚氧氫化蓖麻油

對二甲氨基甲 (DMAB)Bcl-2 (D55G8) Rabbit mAb (Human Specific)2-基呋喃

特地唑;特地唑酸酯Tie2 (AB33) Mouse mAb硅藻土

酚紅鈉鹽Phospho-Tie2 (Ser1119) Antibody氧基椰油烷基

甲基-2-并噻唑酮腙鹽酸鹽，水合β-Amyloid (D54D2) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjuga)N,N'-二甲基-1,2-環(huán)己二

赤蘚紅;赤蘚紅B鈉鹽Phospho-PI3 Kinase p85 (Tyr458)/p55 (Tyr199) Antibody順式-羥基-L-脯氨酸

達拉菲尼,達帕菲尼Phospho-PI3 Kinase p85 (Tyr458)/p55 (Tyr199) Antibody3,5-二溴甲酸

安賽蜜；AK糖Phospho-PI3 Kinase p85 (Tyr458)/p55 (Tyr199) Antibody甲酸甲酯

酰檸檬酸三丁酯NaPi2b/SLC34A2 (D6W2G) Rabbit mAbSOLUTOL HS 15

酰檸檬酸三酯Dexras1 Antibody2-溴-4'-酮

海藻酸nNOS (C7D7) Rabbit mAb對溴甲酸甲酯

維生素C棕櫚酸酯/L-抗壞血酸棕櫚酸酯EI24 (D3F6Z) Rabbit mAb氨基甲酸甲酯

阿斯巴甜Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjuga)對甲酸甲酯

克拉維酸Fas (C18C12) Rabbit mAb肼基甲酸

20S蛋白酶體(20SP)ELISA試劑盒PROK1/PRK1/EG-VEGF  內分泌腺衍生血管內皮生長(cháng)因子100 ul

2,3-二酸甘油酸(2,3-DPG)ELISA試劑盒Phospho-PRK1 (Thr774)/PRK2 (Thr816)  酸化內分泌腺衍生血管內皮生長(cháng)因子100 ul

Ⅰ型前膠原羧基端肽(PⅠCP)ELISA試劑盒VEGF-C  血管內皮生長(cháng)因子C型100 ul

Ⅰ型前膠原N端前肽(PⅠNP)ELISA試劑盒VEGFB  血管內皮生長(cháng)因子B300 ul

Ⅰ型前膠原C末端肽(CTX-Ⅰ)ELISA試劑盒VEGF-D  血管內皮生長(cháng)因子D型100 ul

Ⅰ型前膠原(PCⅠ)ELISA試劑盒VEGFR1  血管內皮生長(cháng)因子受體120 ul

Ⅰ型膠原N末端肽(NTX)ELISA試劑盒VEGF Receptor 2/VEGFR2  血管內皮生長(cháng)因子受體2100 ul

Ⅰ型膠原C端肽(CTX-Ⅰ)ELISA試劑盒phospho-VEGF receptor 2 (Tyr951)  酸化血管內皮生長(cháng)因子受體220 ul

Ⅰ型膠原(Col Ⅰ)ELISA試劑盒phospho-VEGF receptor 2 (Tyr1059)  酸化血管內皮生長(cháng)因子受體2100 ul
豬水皰性口炎(VSV)核酸試劑盒說(shuō)明書(shū)生長(cháng)激素釋放激素同源盒蛋白1抗體Oleandrin中文名：別名：分子式：C32H48O9

特異性囊腫病液體蛋白15β-Anhydrouzarigenin中文名：別名：β-Anhydroepidigitoxigenin分子式：C23H32O3

眼發(fā)育相關(guān)基因蛋白ODAG抗體Tenacigenin B中文名：別名：分子式：C21H32O5

腺苷酸環(huán)化酶Gα蛋白/Gαs/olf抗體Uzarigenin中文名：別名：Odorigenin B分子式：C23H34O4

谷氨酸受體紅藻氨酸離子2/谷氨酸受體6抗體Odoroside H中文名：別名：Digitoxigenin digitaloside分子式：C30H46O8