熒光定量PCR試劑盒采用標本RNA逆轉錄(RT)-實(shí)時(shí)熒光擴增(PCR)兩步合并單管反應,操作簡(jiǎn)便；采用熒光染料的實(shí)時(shí)定量PCR,靈敏度高于熒光探針PCR一個(gè)數量級,每個(gè)反應達10個(gè)拷貝/次；自主產(chǎn)權不形成二聚體的引物設計使PCR反應背景干凈,特別對于極低濃度病毒樣本定量準確,對弱陽(yáng)性判讀可靠；選取人腸道病毒(EV)最保守的5’端非編碼區特異序列5’UTR(423-440)反意義鏈作為逆轉錄引物和PCR下游引物,5’UTR(191-208)序列為PCR上游引物,擴增產(chǎn)生250bp片段,特異性達100%；聚合酶熱啟動(dòng)、中間同序引物對等優(yōu)化措施使系統重復性好。
實(shí)時(shí)熒光PCR定量分析是通過(guò)實(shí)時(shí)檢測擴增產(chǎn)物量與起始靶基因量直接相關(guān)而定量。擴增產(chǎn)物熒光信號達到對數期的循環(huán)數Ct值與靶模板起始拷貝數的對數存在負相關(guān)線(xiàn)性關(guān)系。即起始模板稀釋一倍達到對數期熒光強度所需的擴增循環(huán)就要增加一個(gè)循環(huán)數（Ct值）。
熒光定量PCR試劑盒的標本預處理說(shuō)明：
選直腸試子或糞便浸出液(或血清、腦脊液、細胞培養物)0.1ml,糞便浸出液須自然沉淀10分鐘,取上清0.1ml(或0.1g固體標本)加裂解液1ml(0.5ml的4M異硫氰酸胍+0.5ml水飽和酚)變性裂解，強烈漩渦振蕩，再加100μl氯仿振蕩，最高速離心10分鐘，取上清加3×結合緩沖液(6M碘化納NaI)移至商業(yè)硅膠純化柱，用洗滌緩沖液(含70%EtOH的2M NaI液)洗柱兩次，加50μl DEPC處理的dH2O洗脫、離心收集純化的RNA?；蛄呀馍锨寮拥攘慨惐己?/10體積的2M醋酸鈉(PH4.0)置-20℃2小時(shí)再離心沉淀，75%冷乙醇洗滌一次，加50μl DEPC處理的dH2O溶解。
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更新時(shí)間：2021-10-15
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