在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應，即加標本和加酶結合物后?？乖贵w反應的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育，有人稱(chēng)之為孵育，在ELISA中似不恰當。ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會(huì )，只有貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過(guò)程，因此需經(jīng)擴散才能達到反應的終點(diǎn)。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應總是需要一定時(shí)間的溫育。

　　溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實(shí)驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。在建立ELISA方法作反應動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，實(shí)驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37℃經(jīng)1-2小時(shí)，產(chǎn)物的生成可達峰值。為加速反應，可提高反應的溫度，有些試驗在43℃進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度?？乖贵w反應4℃更全，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過(guò)夜，以形成最多的沉淀。但因所需時(shí)間太長(cháng)，在ELISA中一般不予采用。

　　保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴，可將ELISA板置于水浴箱中ELISA板底應貼著(zhù)水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時(shí)可讓反應板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA板應放在濕盒內，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規定的溫度，特別是在氣溫較低的時(shí)候更應如此。無(wú)論是水浴還是濕盒溫育，反應板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應，操作時(shí)的室溫應嚴格限制在規定的范圍內，標準室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時(shí)可根據說(shuō)明書(shū)的要求控制溫育。室溫溫育時(shí)，ELISA板只要平置于操作臺上即可。應注意溫育的溫度和時(shí)間應按規定力求準確。為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測定。